Ab 1933 versuchten die Nationalsozialisten, die evangelische Kirche gleichzuschalten. Ihre menschenverachtende Ideologie fiel innerhalb der Kirche insbesondere bei der Gruppierung der Deutschen Christen auf fruchtbaren Boden. In der Steglitzer Gemeinde und im Markusbezirk bildete sich 1933-1934 jedoch auch eine innerkirchliche Opposition heraus, die sich gegen die Vereinnahmung der Kirche durch die Nationalsozialisten wandte. Zu dieser oppositionellen Richtung, aus der im Jahr 1934 die Bekennende Kirche hervorging, gehörte auch Pfarrer Otto Großmann vom Markusbezirk. Er weigerte sich, am 2. Juli 1933 einen Dankgottesdienst anlässlich der staatlich verordneten neuen Verfassung der Kirche abzuhalten.
Ab Mitte der 1930er Jahre zählte die Steglitzer Gemeinde zu den wenigen Berliner Gemeinden, die weitgehend von der Bekennenden Kirche geprägt waren. Ein zentrales Ereignis für den Markusbezirk war die dritte altpreußische Bekenntnissynode, die vom 23. bis 26. September 1935 im Markus-Gemeindehaus tagte. Hier ging es wenige Tage nach den Nürnberger Gesetzen um die Frage, wie sich die Bekennende Kirche zu den Verfolgten – den Juden und den Christen jüdischer Herkunft – stellen würde. Einige Mitglieder der Steglitzer Gemeinde nahmen das unermessliche Leid wahr, das den Verfolgten durch das NS-Regime zugefügt wurde, und unterstützten „nichtarische“ Gemeindeglieder.
Der von Deutschland ausgegangene Zweite Weltkrieg kehrte schließlich an seinen Ausgangpunkt zurück – mit verheerenden Bombenangriffen auf deutsche Großstädte. In Steglitz wurde neben vielen Wohnhäusern auch die Markuskirche zerstört.